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纯系养成——单倍体诱导技术(二)

CENH3在植物中广泛存在,并且其功能在各个物种中保守。将两种经修饰的CENH3分别转入拟南芥cenh3-1胚致死突变体,均可恢复植株的野生表型。GFP-CENH3植株与野生型杂交,也能够诱导单倍体的产生,但其频率低于GFP-tailswap。转基因实验结果表明,CENH3组蛋白折叠结构域保守残基中的各种突变并不会使单倍体诱导系的外观不正常,并且自花授粉时完全可育,在异系杂交时可诱导单倍体。左侧表

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CENH3在植物中广泛存在,并且其功能在各个物种中保守。将两种经修饰的CENH3分别转入拟南芥cenh3-1胚致死突变体,均可恢复植株的野生表型。GFP-CENH3植株与野生型杂交,也能够诱导单倍体的产生,但其频率低于GFP-tailswap。转基因实验结果表明,CENH3组蛋白折叠结构域保守残基中的各种突变并不会使单倍体诱导系的外观不正常,并且自花授粉时完全可育,在异系杂交时可诱导单倍体。左侧表示转基因两步法,CENH3敲除可由CRISPR/Cas9生成或从EMS诱变群体中挑选,并用修饰过的CENH3互补。该研究从拟南芥EMS诱变后代中鉴定了另外31个单个氨基酸替换的CENH3等位基因,将其导入cenh3敲除突变体,可以补偿内源CENH3的敲除效应,转基因植株接受野生型花粉后能够诱导单倍体的产生。

背景简介

在“单倍体诱导技术(一)”中,我们了解到通过单倍体诱导进行的单倍体加倍育种技术(Doubled haploid breeding)是近年来兴起的一种革命性纯系育种方法,只需要两代即可得到纯合的DH系,而传统的自交方法需要6-8代才能产生纯系,因此,单倍体加倍育种技术可以大大缩短育种进程。

目前,单倍体的获得方法有组织培养、CENH3介导的单倍体诱导、单倍体诱导系诱导等,在“单倍体诱导技术(一)”中,我们重点介绍了单倍体诱导相关基因MTL/ZmPLA1/NLD以及DMP的研究。在本文中我们将重点介绍单倍体诱导的另一个方法,即CENH3介导的单倍体诱导。

CENH3(着丝粒组蛋白3)是核小体组蛋白H3的变异体,仅存在于真核生物的功能着丝粒中,其主要参与着丝粒复合蛋白的募集和稳定,是细胞分裂时染色体分离所必需的,对着丝粒在染色体上的定位起重要作用(Sullivan et al., 2001)。类似于其他组蛋白,CENH3由两个结构域组成,一个N端尾巴(从核小体伸出,是翻译后表观修饰的靶点)和一个C端组蛋白折叠结构域(c-terminal histone fold domain, HFD)(Britt and Kuppu, 2016)。CENH3在植物中广泛存在,并且其功能在各个物种中保守。

序列替换或点突变的CENH3可补偿cenh3的突变,形成单倍体诱导系,同野生型植物杂交诱导单倍体的产生。近年来,CENH3介导的单倍体诱导方法在拟南芥、玉米、小麦上均取得了重要进展,接下来就和伯小远一起来看看相关的研究成果吧!

拟南芥

研究进展一

2010年3月25日,Ravi和Chan在Nature杂志上发表了题为“Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination”的研究论文,该研究发现CENH3的突变会导致合子发育过程中亲本染色体消除而产生单倍体,即利用修饰过的CENH3突变体材料cenh3与野生型材料进行杂交,在杂交后代中,来自突变体的染色体在融合后会被清除掉,从而形成了只有野生型材料染色体的单倍体材料。

该研究中主要采用两种途径修饰CENH3(图1),一种是在CENH3的N端融合绿色荧光蛋白(GFP-CENH3),另一种是用At1g13370编码的组蛋白H3.3的N端代替CENH3的N端,并融合GFP(GFP-tailswap)。将两种经修饰的CENH3分别转入拟南芥cenh3-1胚致死突变体,均可恢复植株的野生表型。GFP-tailswap植株仅能产生少量花粉,将其作为母本,与不同生态型拟南芥杂交,存活后代中能产生25%~45%仅含野生型染色体的单倍体,其余为二倍体和非整倍体。GFP-CENH3植株与野生型杂交,也能够诱导单倍体的产生,但其频率低于GFP-tailswap

GFP-CENH3GFP-tailswap植株自交后代没有出现单倍体。野生型作为母本与GFP-tailswap杂交,后代也可出现单倍体,但比例极低(表1)。这些拟南芥单倍体材料可以通过非减数分裂,形成加倍后的双单倍体材料,并且能够永久保持(图2)。

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

图1 利用修饰过的CENH3突变体材料与野生型杂交产生单倍体拟南芥(Ravi and Chan, 2010 )。(a)本研究中使用的GFP-CENH3GFP-tailswap。(b-c)染色体分别在二倍体和单倍体拟南芥中的有丝分裂末期移动。(d-e)染色体分别在二倍体和单倍体拟南芥中的双线期移动。(f)单倍体(右)比二倍体具有更窄的莲座叶。(g)单倍体(右)的花比二倍体小。

表1 单倍体植株仅包含其野生型亲本的核基因组(Ravi and Chan, 2010)。

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

图2 单倍体拟南芥产生自然的二倍体后代(Ravi and Chan, 2010)。(a-l)二倍体(a-d)和单倍体(e-l)拟南芥中的减数分裂。(m)单倍体拟南芥植株体细胞中染色体的自发加倍,在单倍体植株上产生可育的二倍体分枝。

研究进展二

2015年9月9日,Britt教授团队在PLoS Genetics上发表了题为“Point Mutations in Centromeric Histone Induce Post-zygotic Incompatibility and Uniparental Inheritance”的研究论文,该研究发现点突变造成的HFD单个氨基酸改变会降低CENH3的着丝粒结合功能,这导致一些后代中的单亲遗传,促进了单倍体的产生。

该研究首先选择了六个突变等位基因(表2),并测试了它们互补cenh3-1突变体后,与野生型拟南芥杂交产生单倍体的能力。CENH3点突变体(tg cenh3*)被转化到CENH3/cenh3-1植物中,并对它们的后代进行了转基因和天然CENH3基因型的筛选(图3)。转基因实验结果表明,CENH3组蛋白折叠结构域保守残基中的各种突变并不会使单倍体诱导系的外观不正常,并且自花授粉时完全可育,在异系杂交时可诱导单倍体。因此,该研究猜测单倍体诱导系可能存在于诱变群体中,为了验证这一假设,作者分析了先前报道过的TILLING(targeting induced local lesions in genomes)群体,该EMS(Ethly methane sulfonate)处理的群体的突变密度为每兆碱基每株植物约3.89个突变。最终结果表明,利用EMS诱变和TILLING技术鉴定到了多个保守氨基酸位点(如P82S,G83E,A132T,A136T,A86V),其任一氨基酸的改变互补cenh3-1突变体后,与野生型拟南芥杂交可诱导单倍体的产生。

表2 本研究中使用的转基因和TILLING系的单倍体诱导率(Kuppu et al., 2015)。

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

图3 转基因CENH3点突变体的转化和杂交示意图(Kuppu et al., 2015)。

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

图4 转基因两步法与非转基因一步法单倍体诱导系的示意图(Kuppu et al., 2015)。左侧表示转基因两步法,CENH3敲除可由CRISPR/Cas9生成或从EMS诱变群体中挑选,并用修饰过的CENH3互补。右侧为非转基因一步法,功能点突变体可通过TILLING或从自然变异中挑选出来,并直接用作单倍体诱导系。中间显示了每种方法的预估生成时间。

研究进展三

2020年2月24日,Britt教授团队在Plant Biotechnology Journal杂志上发表了题为“A variety of changes, including CRISPR/Cas9 mediated deletions, in CENH3 lead to haploid induction on outcrossing”的研究论文。该研究从拟南芥EMS诱变后代中鉴定了另外31个单个氨基酸替换的CENH3等位基因,将其导入cenh3敲除突变体,可以补偿内源CENH3的敲除效应,转基因植株接受野生型花粉后能够诱导单倍体的产生。并且,利用CRISPR/Cas9编辑技术获得了保守的CENH3组蛋白折叠结构域中αN螺旋的移码突变类型,该类型为优良的单倍体诱导系,用野生型花粉授粉时诱导系生长和发育正常。这些发现为作物育种者培育单倍体诱导系,提供了更多的选择。

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

图5 拟南芥具有突变位点的CENH3结构预测(Kuppu et al., 2020)。(a)AtCENH3预测的结构与核小体3av1(一种携带组蛋白3.2的人类核小体)(Tachiwana et al., 2011)对齐。(b)AtCENH3带有指示突变位置的侧链:蓝色=单倍体诱导物,红色=非诱导物,绿色=致死。(c)alphaN螺旋(TVALKEIRHFQK)和N端尾区(SQKKSYRYRPG)的紧邻11个氨基酸的静电荷显示为空间填充模型。蓝色表示带正电,红色表示带负电。

研究进展四

2021年11月19日,Luca Comai教授团队在Science Advances杂志上发表了题为“Epigenetically mismatched parental centromeres trigger genome elimination in hybrids”的研究论文。该团队在论文中提出了一个CENH3介导的单倍体诱导模型(图6):在成熟的母细胞中,CENH3变体会被选择性地从染色质中去除,但野生型中的CENH3不受影响;杂交后,CENH3弱化的母本着丝粒会与父本野生型着丝粒竞争加载CENH3;由于协同结合效应,CENH3会优先加载在野生型亲本的着丝粒上;在随后的有丝分裂过程中,单倍体诱导系的染色体由于其弱着丝粒而不能正常分离;其中,VIM1介导的泛素化或甲基化可以影响CENH3的稳定性,并且VIM1有利于CENH3的加载。

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

图6 拟南芥中CENH3介导的单倍体诱导模型(Marimuthu et al., 2021)。

小远有话说

拟南芥CENH3基因自2010年被报道以后,便迅速引起了科学家们的研究热潮,已有的研究报道表明,通过突变该基因,在拟南芥中可以产生约30%的种内亲本单倍体诱导。然而虽然CENH3的功能在各个物种中保守存在,但是,令人失望的是,众多科学家花费了巨大的努力尝试在其它作物上重复拟南芥上的研究,但都没有获得成功。面对如此困境,科学家们仍然没有放弃对它的研究,终于,皇天不负有心人,近几年在作物上的研究终于取得了一定的进展。

玉米

玉米是我国重要的粮食作物,目前在农业生产中种植的玉米品种主要是由纯合自交系组配而形成的杂交种,因此自交系的选育是玉米育种的关键环节。通过使用单倍体育种的方法可以快速选育出稳定遗传的自交系材料,大大缩短育种周期。在纯系养成——单倍体诱导技术(一)中我们了解到,可以通过使用玉米单倍体诱导系Stock6作为父本诱导系来诱导母本单倍体。除了这种方法外,诱导单倍体的另一种方法是通过着丝粒介导。在玉米中,先正达公司Kelliher等(2016)率先开展了玉米中CENH3介导单倍体产生的相关研究。

研究进展一

2016年3月31日,Kelliher团队在Frontiers in Plant Science杂志上发表了题为“Maternal Haploids Are Preferentially Induced by CENH3-tailswap Transgenic Complementation in Maize”的研究论文,该研究通过改造玉米CENH3成功获得仅含野生型基因组的单倍体。

Kelliher等人首先通过检索玉米UniformMu突变体库,得到了一个ZmCENH3-/-(GRMZM2G158526)纯合致死突变体,同时他们还利用RNAi干扰技术降低内源ZmCENH3的表达得到了ZmCENH3:RNAi系;然后,该团队将两种改变后的CENH3融合基因(AcGREEN-tailswap-CENH3AcGREEN-CENH3)分别转入玉米ZmCENH3-/-突变体和ZmCENH3:RNAi系,得到了4个转基因功能互补系(图7);最后,将这些转基因系与野生型杂交,检测后代单倍体的诱导率。

研究显示,AcGREEN-CENH3AcGREEN-tailswap-CENH3互补ZmCENH3:RNAi系与野生型玉米杂交的单倍体诱导频率平均为0.16%,其中AcGREEN-tailswap-CENH3作为父本与野生型杂交,后代单倍体比例可达到0.24%。AcGREEN-CENH3AcGREEN-tailswap-CENH3互补ZmCENH3-/-突变体与野生型杂交都可产生单倍体。但CENH3融合基因拷贝数不同,产生单倍体频率不同。当AcGREEN-tailswap-CENH3融合基因杂合时,作为父本与野生型杂交所得后代单倍体比例最大可达3.6%(表3)。虽然该诱导效率低于拟南芥CENH3介导的单倍体诱导效率,但为进一步优化CENH3单倍体诱导技术在作物中的应用奠定了基础。

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

图7 研究中测试的四种CENH3互补策略的概述(Kelliher et al., 2016)。

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

图8 AcGREEN-tailswap-CENH3定位于着丝粒(Kelliher et al., 2016)。(A)CENH3定位在盾片核中呈点状;(B)为A图的特写,箭头表示一个CENH3+着丝粒。(C)CENH3定位于减数分裂前花药的表皮和内皮细胞的细胞核,箭头表示一个表皮细胞核,带有几个离散的CENH3+着丝粒。(D)在转基因无效个体中未观察到CENH3,箭头表示一个盾片核,其中没有可见的CENH3+着丝粒。PI,碘化丙啶;ep,表皮细胞;en,内皮细胞。

表3 与CENH3突变转基因玉米品系异系杂交后单倍体诱导率(HIR)数据的总结(Kelliher et al., 2016)。

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

图9 玉米中基于CENH3介导的单倍体诱导结果(Kelliher et al., 2016)。

研究进展二

2021年1月20日,R. Kelly Dawe教授团队在Science Advances杂志上发表了题为“Haploid induction by a maize cenh3 null mutant”的研究论文,该团队利用cenh3无效突变的杂合子进行杂交获得玉米单倍体,极大简化了玉米单倍体的获得方法。

该研究首先通过CRISPR/Cas9技术获得了cenh3无效突变体,其突变类型为移码突变并在突变位点之后产生了一个终止子,进而去除了CENH3上的一大片功能区域(图10)。杂合突变体自交后,其后代没有任何纯合植株,这表明该突变纯合致死。当+/cenh3杂合突变体分别作为父本或母本,与野生型进行杂交后,通过染色体计数和流式细胞仪分析(图11)发现,当+/cenh3作为父本时,单倍体诱导效率为0.5%,而当+/cenh3作为母本时,单倍体诱导效率为5%。此外,该研究使用的诱导系是杂合子,与以往不同该诱导系的植株十分茁壮,并且可以与任何株系杂交一代之后即可得到稳定的单倍体植株(图12)。

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

图10 通过CRISPR/Cas9产生玉米cenh3无效突变体(Wang et al., 2021)。(A)Ubi-Cas9包括一个由玉米多聚泛素启动子驱动的密码子优化的Cas9;gRNA-ImmuneCENH3包括靶向CENH3第四个外显子的gRNA以及由2.2kb CENH3天然启动子驱动的不可切割的ImmuneCENH3基因;TailswapCENH3是基于ImmuneCENH3,但包括修改后的N端尾部和GFP标签。(B)玉米CENH3基因显示了用于基因编辑的序列。(C)野生型和突变体CENH3的预测蛋白序列,终止密码子出现在αN螺旋的第三个位置,这种截短的蛋白质可能与核小体外表面的DNA相互作用,但缺乏介导与核小体核心颗粒内其他组蛋白相互作用的序列。

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

图11 单倍体植株的确认(Wang et al., 2021)。(A)流式细胞仪检测是否为单倍体。(B)染色体传播,玉米二倍体有20条染色体,而单倍体有10条。(C)单倍体植物株型矮小。(D)单倍体植株不育,没有花药。

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

图12 基于GFP-tailswap的方法与cenh3无效突变体方法的比较(Wang et al., 2021)。(A)GFP-tailswap方法及其改进形式:在大多数应用中,表达结构改变的CENH3或其他突变形式的转基因用于补充功能丧失突变。EMS诱导的天然CENH3点突变也会被使用。在所有情况下,植物生长到成熟时都必须带有部分功能失调的CENH3基因,这会影响植株的性能。(B)cenh3无效突变体方法:单倍体诱导发生在配子体水平,图中显示了雌性配子体,其中三个有丝分裂细胞分裂将卵细胞中的CENH3稀释到低水平。

小麦

杂交小麦被认为是今后全球小麦产量大幅提升的首选途径之一。但是,由于小麦受基因组复杂性(异源六倍体)所限,小麦杂交育种一直停滞不前。同时,制种成本过高也大大制约着杂交小麦产业化推广。

2020年11月9日,吕建团队和Timothy Kelliher团队在Nature Biotechnology杂志上发表了题为“Generation of paternal haploids in wheat by genome editing of the centromeric histone CENH3”的研究论文。该研究通过筛选基因组编辑的TaCENH3α-杂等位基因组合,研究人员报道了小麦中可商业操作的父本单倍体诱导系(HI),其单倍体诱导率(HIR)为7%。

该研究首先在小麦中鉴定了CENH3的同源基因TaCenH3αTaCenH3β,进一步检测发现TaCenH3α在子房和花粉中的表达高于TaCenH3β(图13a)。因此,作者设计了两个单gRNAs位点靶向TaCenH3α的三个等位基因:gRNA1靶向外显子1中N末端结构域的起始,而gRNA2靶向内含子2/外显子3剪接位点(图13b)。通过基因编辑对TaCENH3α的三个等位基因进行突变,重点关注的T0植物具有基因型(+/r,-/r,-/-):即具有一个野生型和一个RFS(restored frameshift)等位基因的杂合子(-A);具有1个敲除突变和1个RFS等位基因的杂合子(-B);以及纯合突变(-D)(图13c)。使上述T0植物繁育出各种T1代,然后让T1代自花授粉,并作为雌性与野生型品系03S0352-22回交,以检测HIR。

结果表明,G23基因型(+/r,-/-,-/-)通过自花授粉得到6.9%(9/131)的单倍体,异系杂交后父本HIR为7.0%(4/57),T2代G23的异系杂交父本HIR为8%。此外,G24基因型(r/r,-/-,-/-)植株在T1代和T2代的诱导效率分别为0.7%和1.8%。而T1植物G18(+/+,-/-,-/-)不诱导单倍体,说明位于CENH3α-A的RFS(r)等位基因可能触发HI(表4)。以上结果还证实了TaCENH3α-A的RFS等位基因的杂合(+/r)组合加上-B和-D两个拷贝的敲除突变导致高HIR。

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

图13 基因组编辑策略和HI等位基因的生成(Lv et al., 2020)。(a)CENH3αCENH3β的三个等位基因在不同组织中的表达情况。(b)gRNA1和gRNA2在CENH3α上的靶向位置。(c)G23和G24单倍体诱导植物的基因型。

表4 不同基因型植株T1和T2代异系杂交后父本HIR数据(Lv et al., 2020)。

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

图14 单倍体和诱导植株表型比较(Lv et al., 2020)。

单倍体获得方法简介

纯系养成——单倍体诱导技术(二)

小远叨叨

文章至此就告一段落了,CENH3介导的单倍体诱导技术虽然是近十几年才逐渐发展起来的,但是它在单倍体加倍育种技术上具有非常大的应用潜力,是快速获得单倍体的有效策略之一。希望大家可以通过阅读本文来对目前CENH3介导的单倍体诱导技术的研究进展有一定的了解,文中总结不到位的地方,伯小远在此也欢迎大家进行补充哦!

References:

Britt AB, and Kuppu S. Cenh3: An emerging player in haploid induction technology. Front. Plant Sci. 2016, 7:357.

Kuppu S, Tan EH, Nguyen H, et al. Point Mutations in Centromeric Histone Induce Post-zygotic Incompatibility and Uniparental Inheritance. PLoS Genet. 2015, 11(9):e1005494.

Kelliher T, Starr D, Wang W, et al. Maternal Haploids Are Preferentially Induced by CENH3-tailswap Transgenic Complementation in Maize. Front Plant Sci. 2016, 7:414.

Kuppu S, Ron M, Marimuthu MPA, et al. A variety of changes, including CRISPR/Cas9-mediated deletions, in CENH3 lead to haploid induction on outcrossing. Plant Biotechnol J. 2020, 18(10):2068-80.

Lv J, Yu K, Wei J, et al. Generation of paternal haploids in wheat by genome editing of the centromeric histone CENH3. Nat Biotechnol. 2020, 38(12):1397-1401.

Marimuthu MPA, Maruthachalam R, Bondada R, et al. Epigenetically mismatched parental centromeres trigger genome elimination in hybrids. Sci Adv. 2021, 7(47):eabk1151.

Ravi M, Chan SW. Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination. Nature. 2010,464(7288):615-8.

Sullivan BA, Blower MD, and Karpen GH. Determining centromere identity: cyclical stories and forking paths. Nature Rev. Genet. 2001, 2(8):584-596.

Tachiwana, H., Osakabe, A., Shiga, T., et al. Structures of human nucleosomes containing major histone H3 variants. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2011, 67:578-583.

Wang N, Gent JI, Dawe RK. Haploid induction by a maize cenh3 null mutant. Sci Adv. 2021, 7(4):eabe2299.

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